[หน้าแรก] [ปฏิบัติการ]

           บท6 เรื่องลิงค์เกทและครอสซิ่งโอเวอร์ (Linkage and Crossing over)

       ตามกฎของ  Independent Assortment ของ Mendel ระบุว่า gene แต่ละตัวจะมีความเป็นอิสระต่อกัน  โดยอยู่บนโครโมโซมคนละแท่ง แต่ในการทดลองสมัยต่อมาพบว่า เมื่อทำการทดลองกับ gene 2 คู่ใน…………    ในบางครั้งไม่สามารถอธิบายการเกิด ratio ของ offspring ได้ด้วยกฎของ Mendel  จึงได้มีการศึกษาและต่อมาก็ได้ทราบว่า เนื่องจากในโครโมโซมแต่ละแท่งนั้นมี gene ได้หลายตัว  และการแสดงของสภาพ  gene 2 ตัวที่อยู่บนโครโมโซมแท่งเดียวกัน คือ การแสดงออกของ Linked gene   Gamete จาก Linked gene 2 คู่ จะมี จะไม่มีโอกาส  เช่นเดิม แต่จะเป็น  เนื่องจาก  gene ทั้ง 2 ไม่แยกกัน หากไม่เกิด crossing over แต่หากเกิด crossing over แล้วโอกาสจะเป็น recombinant gamete จะมีประมาณน้อยกว่าถึงเท่ากับ 50% ของ gamete ขึ้นอยู่กับระยะห่างระหว่าง gene ทั้ง 2 นั้น
       ลักษณะที่ได้ศึกษาในปฏิบัติการครั้งนี้ รวมถึงวิธีการทางพันธุศาสตร์อื่นๆ ที่ศึกษาด้วยนั้น เป็นเนื้อหาที่ได้มีการศึกษาสั่งสมมานับตั้งแต่สมัยของ Mendel ซึ่งสามารถอธิบายปรากฏการณ์บางอย่างที่กฎของ Mendel ไม่สามารถอธิบายได้ และความรู้ทางพันธุศาสตร์ที่พัฒนาอย่างรวดเร็วก็ทำให้การทำแผนที่ของ gene ในโครโมโซมของสิ่งมีชีวิตต่างๆ โดยเฉพาะของคน เพื่อการศึกษาผลของ gene ต่อการแสดงออกลักษณะในเบื้องลึกต่อไป

     วัตถุประสงค์
1.เพื่อเข้าใจถึงสภาพของ Linked gene
2.เพื่อเข้าใจถึงแบบต่างๆ ของ Linkage
3.เพื่อเข้าใจถึงผลของ progeny ของ F2 และ test cross ที่เกิดจาก  Linked gene
ที่แตกต่างจาก  Independent gene
4.เพื่อเข้าใจถึงวิธีการหาร % crossover ของ Linked gene
 

Linkage

รูป A.
เรียก  Homologous Chromosome ที่มาเข้าคู่กันว่า Tetrad ซึ่งมักจะเกิด Crossing - over ซึ่งจะได้ gametes 4  แบบ คือเป็น Parental type 2 แบบ และ recombinant type อีก 2 แบบ

รูป B.
G= Gray bodyg =black body
L= Long wingsl  =vestigial wings
ดังนั้น  ตัวเมียมี genotype เป็น GgLl เมื่อสร้าง gamete (egg) จะเกิด Crossing - over ทำให้ได้ 4  แบบ คือ GL, gl,  Gl, gL  ส่วนตัวผู้มี genotype เป็น ggll จะได้  gamete (sperm) แบบเดียวคือ  gl เพราะแม้จะเกิด crossing - over ก็ไม่มีการเปลี่ยนแปลง
เมื่อนำ    มาผสมกับ    จะได้ลูก F1 ที่เป็น Parental type = 1909 และเป็น Recombinants =  391  เมื่อนำไปหา % Recombinant = 17% ซึ่ง % Recombinant สามารถบอกระยะห่างของ gene ทั้ง 2 ได้  เมื่อกำหนดให้ 1 map unit =  1% Recombinant  ดังนั้น ยีน g อยู่ห่างจากยีน  l เป็นระยะทาง 17 mu.
จากแผนภาพ
Recombination frequency  =     = 0.17 or 17%
แสดงว่า  แมลงหวี่มี gamete map =  17% คือระยะห่างจากยีนในโครโมโซม  = 17
หน่วยแผนที่

Genetic Map ของแมลงหวี่
สามารถบอกได้ว่า  แมลงหวี่มี  4 Linkage group และในแต่ละ Linkage gr. มียีน
ควบคุมลักษณะใดอยู่ที่ตำแหน่งไหนบ้าง
เช่น แท่งที่ 1 มียีนที่ควบคุมลักษณะ black body อยู่ที่ตำแหน่ง 48.5 และมียีน
ยีนควบคุมลักษณะ  speck body อยู่ที่ตำแหน่ง 107.0
การศึกษาการผสมพันธุ์และการถ่ายทอดกรรมพันธุ์แมลงหวี่  การคัดเลือกลักษณะพันธุ์
ใหม่ๆ หรือที่เรียกว่า มิวแทนต์ ไว้เป็นจำนวนมาก สามารถจำแนกลักษณะกรรมพันธุ์ต่างๆ เหล่านั้น ออกเป็นกลุ่มลิงเกจได้  4 กลุ่ม

Genetic map ของมะเขือเทศ
มะเขือเทศมี  Linkage group เท่ากับ  12  สามารถบอกได้ว่ายีนที่ควบคุมลักษณะใดอยู่ที่  Chromosome แท่งใดที่ตำแหน่งเท่าไร
เช่น ยีนที่ควบคุมลักษณะใบแบบ  Normal (ลักษณะเด่น) กับแบบ Mottled  (ลักษณะด้อย) อยู่บน chromosome แท่งที่ 1 อยู่ที่ตำแหน่ง 12
ยีนที่ควบคุมลักษณะ Cutleaf  (ลักษณะเด่น) กับ Potato leaf  (ลักษณะด้อย) อยู่บน
Chromosome แท่งที่ 4 อยู่ที่ตำแหน่ง 12 เป็นต้น

       The Human Gene Map
สามารถบอกได้ว่าที่ chromosome แท่งใดมียีนอะไรอยู่บ้าง และอยู่ที่ตำแหน่งที่เท่าไรของ  chromosome
เช่น ที่ตำแหน่ง  36 ของ chromosome แท่งที่ 1 มียีน ANP อยู่
จะสังเกตเห็นว่า ที่ chromosome Y จะมียีนอยู่น้อยมาก เพราะ chromosome มีขนาดสั้นมาก การเรี ยงแท่ง chromosome จะให้แท่งที่มีความยาวมากมาก่อนแท่งที่มีความยาวน้อย ฎ เรียง
ตามความยาวของแท่ง Chromosome นั่นเอง
เช่น Chromosome แท่งที่ 1 มีความยาวมากที่สุด  และ chromosome Y สั้นที่สุด

วิธีการทำ Human Genome Mapping โดยการทำ Somatic fusion ระหว่าง cell ของคนกับ cell ของหนู
เมื่อนำ cell ของคนมาทำ Somatic fusion กับ cell ของหนูโดยมี Sendai Virus เป็นตัวกระตุ้นให้เกิด Hybrid cell นำไปเลี้ยงใน HAT medium ต่อมานำ  Hybrid cell clones ที่ได้ไปตรวจสอบ โดยใน Hybrid cell clone แต่ละ cell จะเหลือ Human chromosome อยู่เพียง 1-2 chromosome ตรวจส อบหาลักษณะที่ผิดไปจากหนูปกติ ลักษณะที่ผิดปกตินี้จะถูกควบคุมโดย Human chromosome นั่นเอง จากนั้นให้นำไปตรวจสอบหาตำแหน่งของ Chromosome นี้โดยนำไปเทียบกับ cell ปกติของคน
ดังนั้น การทำ Human Genome Mapping โดยการทำ Somatic fusion นี้บอกให้รู้ว่า ยีนที่เป็น  Marker อยู่ที่ตำแหน่งใดของ chromosome แท่งไหน และควบคุมลักษณะอะไร ซึ่งสามารถนำไปหายีนตำแหน่งอื่นๆ โดยวิธีอื่นต่อไป
ตัวอย่างการหาตำแหน่งของยีนในโครโมโซมของคนโดยใช้เทคนิค Somatic cell hybridization ระหว่าง cell ของคน (2n = 46)  ซึ่งมียีนปกติ TK+ (thymidine kinase) ซึ่งตรวจสอบได้ทางชีว กับเซลล์ขอ งหนูทดลอง (2n = 40) ซึ่งไม่มียีนนี้ (TK-) เซลล์ผสมจะมีโครโมโซม
ทั้งหมด  86  แท่ง  โครโมโซมบางแท่งของคนสามารถตรวจสอบได้โดยดูจากกล้องจุลทรรศน์
ฟลูโอเรสเซสซ์  และมียีน TK+ เลี้ยงเซลล์ผสมต่อไปหลายชั่วอายุ  จะพบว่าหลอดเลี้ยงเซลล์ผสมบางหลอดขาดยีน (TK-) และมีโครโมโซมแท่งที่ 17 ของคนเหลืออยู่แท่งเดียว จึงสรุปว่า ยีน TK อยู่ในโครโมโซมคู่ที่ 17

       Crossing over ในรา
1.จากรูป เป็นการแสดง  Life cycle ของราใน Class Ascomycetes ซึ่งเริ่มจาก A nucleus และ a  nucleus  เกิด  cell fusion และ Nuclear fusion จะได้ A/a
ซึ่ง A/a = 2N และมีการแบ่งนิวเคลียสแบบ meiosis
จาก A/a  = 2N  แบ่งแบบ meiosis ครั้งที่ 1  จะได้ Ascospores จำนวน 2 cell ที่ 1 อันเป็น A และอี ก 1 อันเป็น a  (ดูจากสีที่แตกต่างกัน)  จากนั้นเมื่อแบ่งแบบ Meiosis ครั้งที่ 2  จะได้ Ascospore  จำ นวน 4 cell ที่เป็น A  2 อัน  และ a อีก 2 อัน  จากนั้นก็จะมีการแบ่งแบบ mitosis ไปเรื่อย ทำให้ได้ Ascospore จำนวนมาก อยู่ภายใน Ascus
จากรูปเป็นการแสดงการแบ่ง cell  ที่ไม่เกิด crossing - over ลูกที่ออกมาจึงแยกเป็น 2 ส่วนเท่าๆ กัน เหมือนพ่อแม่ คือ  A =  a
ดังนั้น  วงชีพ Nerospora crassa โดยการเกิด spore  หรือการสร้าง spore เกิดจากการ
fusion ของ cell  จาก A nucleus และจาก a nucleus ได้ cell ที่มีทั้ง A/a  แต่เมื่อแบ่ง cell แบบ meiosis cell division  cell จะแบ่งแยกออกเป็น A nucleus และ a nucleus และแบ่งต่อไปจนครบ 8 cell หรือ  8 spore  โดยครึ่งหนึ่งเป็น A เรียงต่อกัน 4 อัน และอีกครึ่งหนึ่งคือ a เรียงต่อกัน (ไม่เกิด crossing over)
2.เป็นการแสดงการเจริญพัฒนาของ ascospore ใน ascus ซึ่งสังเกตจากการแบ่ง
นิวเคลียส  ซึ่งสามารถตรวจสอบได้ว่า Ascospore cell ใดมาจาก cell แม่ใด  เพราะการแบ่งจะเรียงกั นไปเป็นของแต่ละ cell ไม่มีการสลับกัน เพราะไม่เกิด crossing - over
นั่นคือการแบ่ง cell ได้เป็น spores โดยไม่มีการ crossing - over หรือไม่มี recombinant เกิดขึ้น
การแบ่งแบบที่ 1  ไม่มีการ recombinant หรือ crossing over spore   spore ที่มี A เรียงกัน  4 spore  และ a  เรียงกัน  4 spore
การแบ่งแบบที่ 2 มีการ recombinant  หรือ  crossing over spore spore ที่ได้จะสลับตามแบบที่ chromosome มีการสลับกันในขณะ crossing over
3.รูปแสดงการสืบพันธุ์แบบอาศัยเพศของเชื้อรา class Ascomycetes สังเกต ascospore ใน asci ของแต่ละ perithecia เพื่อศึกษาการเกิด crossing - over
จะเห็นว่า  ลูกที่ออกมาจะมีทั้งลักษณะที่เหมือนพ่อแม่ และแตกต่างจากพ่อแม่
4.เป็นแผนภาพการเกิด  crossing over แบบต่างๆ

คือ No crossover   ฎ ลูกที่ออกมาจะเหมือนพ่อแม่ทุกประการ (parental typeหมด)
Single crossover   ฎมีการ cross over 1 ตำแหน่ง (2 parental ;
2 recombinant)
Double crossover ฎ มีการ cross over 2 ตำแหน่ง (ได้ parental หมด)
Double crossover (3 - strand) ฎ มีการ crossover 2 ตน. แต่ที่ตำแหน่งที่หนึ่ง
เกิดขึ้นพร้อมกัน 5 แขน (ได้ 2 parental : 2 recombinant)
Double crossover (4 - strand) ฎ มีการ crossover 2 ตน. แต่ที่ตำแหน่งที่หนึ่ง
เกิดขึ้นพร้อมกัน 4 แขน (ได้ recombinant หมด)