[หน้าแรก] [เนื้อหา]

               ปฏิบัติการเรื่องลิงค์เกทและครอสซิ่งโอเวอร์

         การศึกษาการเกิด ครอสซิงโอเวอร์ในรา Sordaria fimicola
         รา  Sordaria  fimicola  เป็นราที่อยู่ใน Phylum Ascomycota  ซึ่งราใน Phylum นี้ ลักษณะสำคัญอย่างหนึ่งคือ การสืบพันธุ์แบบอาศัยเพศจะสร้างสปอร์ที่เรียกว่า ascospore ในถุงascus และรวมกันอยู่ในโครงสร้างที่เรียกว่า perithecium  ช่วงชีวิตส่วนใหญ่ของราชนิดนี้เป็นhaploid เมื่อมีการสืบพันธุ์แบบอาศัยเพศ เส้นใยของราจะมาเชื่อมกันซึ่งเส้นใยราที่มาเชื่อมกันนี้อาจเป็นสายพันธุ์เดียวกันหรือต่างสายพันธุ์กันก็ได้  ทำให้นิวเคลียส  2 นิวเคลียสอยู่ในเซลล์เดียวกัน (heterokaryon)แล้วนิวเคลียสทั้ง 2 รวมกันได้ zygote (2N) จาก zygote แบ่ง meiosis และตามมาด้วย mitosis ได้ ascosporeจำนวน 8 อัน

         รา  S. fimicolaเป็นราที่นิยมใช้มากในการศึกษาทางด้านพันธุ์ศาสตร์ โดยเฉพาะใน การศึกษาการแยกตัวของ  ascospore  สีต่างๆที่เป็นผลมาจากการเกิดครอสซิงโอเวอร์ขณะที่มีการแบ่งmeiosis

         วัตถุประสงค์
   1.   เพื่อศึกษาการเกิดครอสซิงโอเวอร์ในราS. fimicola
   2.   หาระยะทางระหว่างยีนกับเซ็นโตเมียร์

         อุปกรณ์
   1.   เชื้อรา Sordaria fimicola  2 สายพันธุ์ คือ พันธุ์ที่ให้ ascospore สีดำ (+) และ
สายพันธุ์สีน้ำตาล (b)
   2.   กล้องจุลทรรศน์
   3.   สไลด์ และกระจกปิดสไลด์
   4.   เข็มเขี่ยเชื้อ
   5.   ตะเกียงแอลกอฮอล์
   6.   แอลกอฮอล์ 70%
   7.   อาหารเลี้ยงเชื้อที่ใช้เลี้ยงราเพื่อกระตุ้นให้เกิดการผสม(crossing media) ซึ่งมีสูตรดังนี้

                          corn meal agar                               17.0         กรัม
                          sucrose                                           10.0         กรัม
                          glucose                                              7.0         กรัม
                          KH₂PO₄                                             0.1        กรัม
                          Yeast extract                                    1.0         กรัม
                          น้ำกลั่น                                                 1.0         ลิตร

        วิธีทำ
  1.   ทำการผสม  Sordaria fimicolaทั้ง 2 สายพันธุ์
         1.1   นำเอาจานเลี้ยงเชื้อที่มีอาหารที่ใช้เลี้ยงราเพื่อกระตุ้นให้เกิดการผสม  ที่ก้นแก้ว
ใช้ปากกาเขียนแก้วขีดเป็น  4  ช่อง และเขียนเครื่องหมาย + และ b สลับกันไว้ ดังรูป กลุ่มละ 2 จาน

         1.2   ใช้เข็มเขี่ยจุ่มลงในแอลกอฮอล์  70%  แล้วลนไฟให้ร้อนแดง  ปล่องทิ้งไว้ให้เย็น ใช้เข็มเขี่ยตัดชิ้นวุ้นที่มีรา  S. fimicolaสายพันธุ์ + และ b  วางลงบนอาหารเลี้ยงเชื้อในจานที่ทำเครื่องหมาย +แ ละ b  นำเชื้อไปเก็บในที่มืดที่อุณหภูมิห้อง
          1.3   เชื้อรา  S. fimicola ทั้ง 2 สายพันธุ์  จะเจริญมาพบกันภายใน 7-10 วันตรงบริเวณรอยต่อ ที่เชื้อรามาพบกัน จะสังเกตเห็นperithecium มีลักษณะเป็นเม็ดสีดำ

      2.   การตรวจดูสปอร์
         2.1   ใช้เข็มเขี่ยลนไฟ  เขี่ยเอา perithecium ตรงบริเวณที่เชื้อราทั้ง2 มาพบกัน วางลงบนสไลด์ ที่สะอาด หยดน้ำ 1 หยด ปิดด้วยกระจกสไลด์
         2.2   ใช้ด้ามเขี่ยกดบนกระจกสไลด์เบาๆ พอให้ preithecium แตกออก นำไปส่องกล้องจุลทรรศ น์  จะเห็น asci ที่มีรูปร่างเป็นถุงยาวๆ หลุดออกมา นับจำนวน  asci ที่ไม่เกิดครอสซิงโอเวอร์และจำนวน asci ที่เกิดครอสซิงโอเวอร์

         ให้ศึกษา Linkage ในแมลงหวี่
   ลักษณะที่ใช้ 2 ลักษณะในแมลงหวี่คือ
1.ลักษณะสีของลำตัว (สีน้ำตาลเทาปกติ , สีดำ )
2.ลักษณะปีก  ( ปีกยาวคลุมลำตัว , ปีกกุด )
P        Gray, Long    X    Black , Vestigial
                                                              

F1 (heterozygote) Gray, Long
ให้F1 ผสมกันเอง ได้ F2
                                                  

 Gray,Long : Black , Vestigial  : Gray, Vestigial : Black, Long
     90           :           92              :      19                 :       17
ให้หาระยะห่างของ gene ทั้ง 2 พร้อมทั้งเขียน แผนที่ gene ด้วย