[หน้าแรก] [เนื้อหา]

           ปฏิบัติการเรื่อง พลาสมิดดีเอ็นเอและการทำแผนภาพีน

       วัสดุและอุปกรณ์
1.วิดิทัศน์เรื่อง การสกัด plasmid DNA จากแบคทีเรีย E.coli
2.ชุดอุปกรณ์แยกสารพันธุกรรมด้วยกระแสไฟฟ้าในแนวนอน
3.plasmid DNA ที่ตัดด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะชนิดต่างๆ
4.Agarose
5.Gel electrophoresis running buffer (0.5x TBE)
6.UV illuminator
7.Micropipette และ pipette tip
8.DNA loading dye
9.สารละลาย ethidium bromide ความเข้มข้น 10 mg/ml

     วิธีปฏิบัติการ
1.บรรจุ 1 kb ladder ซึ่งเป็น DNA มาตรฐานในการระบุขนาดของ DNA fragment ลงใน well  ที่ 1
2.บรรจุ plasmid DNA ที่ตัดด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะลงในช่อง (well) ถัดไป โดยแต่ละ well จะมีเพียง 1 reaction
     plasmid DNA ที่ใช้คือ pPCS ซึ่งเป็น pBR332 vector ที่มีการ clone ยีนที่ต้องการลงในตำแหน่งของเอนไซม์ตัดจำเพาะ BstX I หลังจากการสกัด  plasmid DNA ที่นำมาตัดด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะชนิดต่างๆ ดังนี้

 

reaction 1pPCS digested withBstX I
reaction 2pPCS digested withHind III
reaction 3pPCS digested withXho I
reaction 4pPCS digested withBstX I และ Hind III
reaction 5pPCS digested withHind III และ Xho I

3.ผ่านกระแสไฟฟ้าเข้าสู่แผ่นเจล โดยให้ well อยู่ใกล้กับขั้วลบ (anode) ตั้งโปรแกรมของเครื่องจ่ายกระแสไฟฟ้าแบบ instant voltage และให้มีความต่างศักย์ประมาณ 90 V
4.ให้กระแสไฟฟ้าทำการแยก DNA เป็นเวลาประมาณ 1.5 ชั่วโมง หรือจนสีของ bromphenol blue (สีน้ำเงิน) เคลื่อนที่ไปประมาณ 2 ใน 3 ของแผ่นเจล แล้วหยุดการแยกด้วยกระแสไฟฟ้า
5.นำแผ่นเจลแช่ลงในสารละลาย ethidium bromide เพื่อย้อม DNA เป็นเวลาประมาณ 15 นาที (ethidium bromide เป็น carcinogen ต้องสวมถุงมือทุกครั้งในการทำปฏิบัติการ)
6.นำไปส่องดูรูปแบบของ DNA ที่ได้ด้วย UV illuminator บันทึกผล
7.วิเคราะห์ restriction map ของพลาสมิด pPCS โดยวางตำแหน่งของ Hind III และ Xho I sites

     ผลการทดลอง
ผลการทำ gel electrophoresis เป็นดังภาพ



เมื่อวิเคราะห์ restriction map แล้วได้ผลดังนี้

     สรุปและวิจารณ์
1.inserted fragment DNA มีขนาด = ……………………………..
2.inserted fragment DNA มี Hind III site …………………ตำแหน่ง
3.inserted fragment DNA มี Xho I site…………………….ตำแหน่ง
4.inserted fragment DNA มี Xho I และ Hind III อยู่ห่างกันประมาณ……………kb