[หน้าแรก] [หน้าเนื้อหา]

           ปฏิบัติการ เรื่อง การแบ่งเซลล์และนิวเคลียส (Nucleus and Nuclear division)

     วัสดุอุปกรณ์
1.  กล้องจุลทรรศน์แบบcompound
2.  สไลด์ถาวร สไลด์โปร่งแสง รูปภาพ แผ่น CD (CAI) เรื่องการแบ่งเซลล์ จัดทำโดย รศ.ดร. วรวุฒิ  จุฬาลักษณานุกูล และแผ่น CD (CAI) เรื่องการสืบพันธุ์และวงชีวิต จัดทำโดย ผศ. เตือนใจ  โก้สกุล และคณะ ภาควิชาพฤกษศาสตร์ คณะวิทยาศาสตร์ จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย และภาพยนต์การแบ่งนิวเคลียสแบบไมโตซิสและไมโอซิส และ Web site ชื่อ http://www.sc.chula.ac.th แล้วเลือก Thai ที่อยู่มุมทางซ้ายมือ เพื่อให้ได้เมนูเป็นภาษาไทย จากนั้นให้เลือกเรียนหนังสือ on line  ซึ่งภายใต้หัวข้อเรียนหนังสือ on lineนี้ให้เลือกชื่อเรื่อง continuity of life เมนูย่อยเกี่ยวกับ cell division เพื่อศึกษารายระเอียดของรูปภาพประกอบ
3.  ภาพแสดง mitotic metaphase จากเซลล์ปลายรากของบัวจีน Zephyranthesrosea Linn. (2n = 24) ภาพ mitotic metaphase ของคนปกติและโรคพันธุกรรมบางโรคในคน
4.  สไลด์ และแผ่นแก้วปิด
5.  ปากคีบและเข็มเขี่ย
6.  ตะเกียงอัลกอฮอล์
7.  ปลายรากหอม ดอกกุยช่าย หรือดอกหัวใจม่วง ว่านกาบหอย หรือข้าวโพด
8.  ตั๊กแตนตัวผู้
9.  ดินน้ำมันสีต่างๆ
10.น้ำยา fixative (acetic alcohol)
11.สีย้อม propiono-carmine
12.70% ethyl alcohol
13.HCl 1 N
14.กาวหรือเทป 2 หน้าชนิดบาง
15.กระดานฟอร์เมก้าสีขาว

     วิธีทำ
1.  ศึกษาการแบ่งนิวเคลียสแบบไมโตซิส และไมโอซิสจากภาพยนตร์ สไลด์ภาพโปร่งแสง รูปภาพ สไลด์ถาวรและแผ่น CD (CAI)

2.  เตรียมสไลด์ศึกษาเองของการแบ่งนิวเคลียสแบบไมโตซิสจากปลายรากหอม
       การเตรียมตัวอย่างปลายรากหอมและการย้อมสี
        นำหัวหอมหรือหอมแดงมาเฉือนบริเวณที่เกิดรากติดกับลำต้น วางบนตะแกรงที่อยู่เหนือกะละมังซึ่งมีน้ำอยู่ให้หัวหอมส่วนที่เฉือนแช่น้ำเพียงเล็กน้อย ทิ้งไว้ในที่มืดประมาณ 3-4 วัน จะเกิดรากใหม่ ตัดปลายรากที่เกิดใหม่ ยาวประมาณ 1 เซนติเมตร แช่ลงในสารละลาย acetic alcohol  หรือ  fixative (glacial acetic acid : absolute ethyl alcohol = 1:3) เพื่อหยุดกิจกรรมของเซลล์เป็นเวลาอย่างน้อย30 นาที หากยังไม่ทำการศึกษาในทันทีให้นำเก็บรักษาโดยล้างปลายรากด้วย 70% ethyl alcohol 2-3 ครั้ง แล้วเก็บไว้ใน 70% ethyl alcohol ที่อุณหภูมิ 5องศาเซลเซียส นำรากที่เก็บไว้มาวางบนสไลด์ แล้วหยด 1N HCl (conc.HCl 90 มิลลิลิตร และน้ำกลั่น 910 มิลลิลิตร) 1 หยด ตั้งทิ้งไว้ 5-10 นาที เพื่อทำให้เซลล์พองตัว และละลาย pectin ออกไป จากนั้น ซับ  HCl ด้วยกระดาษทิชชู แล้วหยดน้ำลงไปเพื่อล้างกรดเกลือที่เหลือ การย้อมสีโดยการหยดสี  propiono-carmine (45% propionic acid 100 มิลลิลิตร นำไปต้มให้เดือด แล้วเติมผงสี carmine 2 กรัม คนให้ละลายจนหมด ทิ้งให้เย็น เขย่า แล้วกรองด้วยกระดาษกรอง) 1หยด ทิ้งไว้ 3-5 นาที ตัดปลายรากให้เหลือประมาณ 3-5 มิลลิเมตร ปิดด้วยแผ่นแก้วปิด ใช้ด้ามเข็มเขี่ยกดหรือเคาะบนแผ่นแก้วปิดตรงบริเวณที่มีปลายรากเบาๆ จนปลายรากแผ่กระจายแบนลง แสดงว่าเซลล์กระจายบ้างแล้ว อาจจะนำไปผ่านเปลวไฟ 2-3ครั้ง หรือในขณะที่หยดสีครั้งแรก นำไปลนไฟพอเกิดควันจางๆ อุณหภูมิประมาณ 50-60 องศาเซลเซียส) ก่อนที่ทำให้เซลล์กระจายก็ได้ จากนั้นใช้กระดาษซับวางบนแผ่นแก้วปิด แล้วใช้หัวแม่มือกดให้เซลล์และโครโมโซมกระจายอยู่ในระนาบเดียวกัน จากนั้นนำไปดูด้วยกล้องจุลทรรศน์ ใช้เลนส์วัตถุกำลังขยาย x10 และ x40 เท่าตามลำดับ

3. เตรียมสไลด์ศึกษาเองของการแบ่งนิวเคลียสแบบไมโอซิสจากดอกกุยช่าย หรือดอกหัวใจม่วง หรือดอกว่านกาบหอย หรือดอกข้าวโพด
       การเตรียมตัวอย่างดอกและการย้อมสี
       เก็บดอกระยะก่อนที่ดอกจะบาน ใส่ลงในขวดที่บรรจุน้ำยา fixative ซึ่งเตรียมเสร็จใหม่ๆ ทิ้งไว้ 24 ชั่วโมง แล้วเปลี่ยนไปเก็บที่ 70% ethyl alcohol ในตู้เย็น การย้อมสีนำดอกมาแล้วใช้ปากคีบดึงอับเรณุ 3-5 อัน มาวางบนสไลด์ที่หยด propiono-carmine 1 หยด ใช้เข็มเขี่ยตัดกลางฉีกอับเรณูให้ขาด แล้วกดบนอับเรณูเพื่อให้ไมโครสปอร์หลุดออกมา จากนั้นใช้ปากคีบคีบเอาผนังอับเรณูทิ้งไป ปิดด้วยแผ่นแก้วปิด ใช้ด้ามเข็มเขี่ยกดลงบนแผ่นแก้วปิดเบาๆ นำสไลด์ไปผ่านเปลวไฟ 2-3 ครั้ง เพื่อให้เซลล์พองตัว และโครโมโซมติดสีดี นำสไลด์ไปวางบนกระดาษทิชชู ใช้กระดาษทิชชูวางปิดแผ่นแก้วปิด แล้วใช้หัวแม่มือกดลงกระดาษทิชชูเพื่อให้โครโมโซมกระจาย  นำไปดูด้วยกล้องจุลทรรศน์ ด้วยเลนส์วัตถุกำลังขยาย x10 และ x40 เท่าตามลำดับ

4. เตรียมสไลด์ศึกษาเองของการแบ่งนิวเคลียสแบบไมโอซิสจากtestis ของตั๊กแตน
        การเตรียมตัวอย่างและการย้อมสีศึกษา
       เลือกเฉพาะตั๊กแตนตัวผู้ใส่ขวด ทำให้สลบด้วยน้ำยา ether จากนั้นตัดตรงส่วนท้อง และดึงเอาเฉพาะอัณฑะ (testis) ออกมา (อัณฑะ มีลักษณะเป็นพวงประกอบด้วยถุง follicle ยาวๆ เป็นจำนวนมาก มักมีสีเหลืองอ่อน) นำอัณฑะมาแช่ในน้ำเกลือทันที (0.67% NaCl) และแยกถุง follicle ออกจากกัน แล้วแช่ในน้ำยา fixative 30 นาที จากนั้นนำ follicle มาล้างด้วยน้ำกลั่น แล้วหยดสี propiono-carmine 1 หยด ทิ้งไว้สักครู่ จากนั้นเอาเข็มเขี่ยให้ follicle แตก ให้เซลล์ภายใน follicle กระจายออกมา จึงปิดด้วยแผ่นแก้วปิด ลนไฟ 2-3 ครั้ง และกดเบาๆ เพื่อให้เซลล์กระจายอยู่ในระนาบเดียวกัน จากนั้นนำไปดูภายใต้กล้องจุลทรรศน์ที่เลนส์วัตถุกำลังขยาย x10 และ x40 ตามลำดับ อย่างไรก็ตามการทำโดยวิธีดังกล่าวอาจจะยุ่งยาก หากมีเวลาจำกัดอาจทำได้อีกวิธีหนึ่ง คือนำตั๊กแตนตัวผู้ที่ยังมีชีวิตอยู่ เอากรรไกรตัดบริเวณท้องและเขี่ยส่วนอัณฑะที่ประกอบด้วยถุง follicle วางบนแผ่นสไลด์ และย้อมสีทันทีจากนั้นทำการศึกษาเช่นเดียวกับวิธีแรก

5. การศึกษาพฤติกรรมของยีนและโครโมโซมในระยะต่างๆ ของการแบ่งนิวเคลียสแบบไมโตซิสและไมโอซิสจากการปั้นดินน้ำมัน
       กำหนดให้เซลล์มีจำนวนโครโมโซม2n = 4 (มี metacentric chromosome และacrocentric chromosome อย่างละ 2 แท่ง) ประกอบด้วย โครโมโซมชุดที่รับมาจากฝ่ายแม่ (maternal chromosome) ใช้ดินน้ำมันที่มีสีแดง   โครโมโซมชุดที่รับมาจากฝ่ายพ่อ(paternal chromosome) ใช้ดินน้ำมันที่มีสีเขียว โดยแบ่งพฤติกรรมของยีนและโครโมโซมออกเป็น2 แบบ คือ (ดูรายละเอียดจากภาพที่แสดงด้านล่าง)

แบบที่1  มี gene 2 คู่ อยู่บนโครโมโซมคนละคู่ (nonhomologous chromosome, 2 loci)

แบบที่2  มี gene ทั้งหมด 3 คู่ โดยที่gene 2 คู่แรกอยู่บนโครโมโซมคู่เดียวกัน (Linkage) มี 2 loci ซึ่ง gene 2 คู่นี้ (A,aและ C,c) อยู่บนโครโมโซมเดียวกัน ส่วน geneอีก 1 คู่ (B,b) อยู่บนโครโมโซมอีกคู่หนึ่ง

       หมายเหตุ:       
  kinetochore ใช้สีดำ
   gene A ใช้สีเหลือง                   gene B ใช้สีส้ม                        gene C ใช้สีน้ำเงิน
   gene a ใช้สีม่วง                       gene b ใช้สีฟ้า                        gene c ใช้สีน้ำตาล

       ปั้นดินน้ำมันให้เป็นรูปโครโมโซมตามที่กำหนดไว้ ใช้ดินสอวาดกรอบแสดงเยื่อหุ้มเซลล์ เยื่อหุ้มนิวเ คลียส เส้นใยสปิดเดิล บนกระดาษสีขาวแสดงระยะต่างๆ ของการแบ่งนิวเคลียสแบบไมโตซิส แสดงระยะ Prophase, Metaphase, Anaphase และ Telophase ตามลำดับ ส่วนการแบ่งนิวเคลียสแบบไมโอ ซิส แสดงระยะ Late Prophase I และให้มีการเกิดครอสซิ่งโอเวอร์1 แห่งของ metacentric chromosome และแสดงระยะต่างๆ คือ Metaphase I  Anaphase I  Telophase I และ Metaphase II  Anaphase II และ Telophase II ตามลำดับ โดยการปั้นโครโมโซมด้วยดินน้ำมันตามรูปที่ควรจะเป็น ให้มีรูปร่างและขนาดที่สมจริง โดยวางบนตำแหน่งต่างๆ ภายในกรอบเซลล์ที่กำหนดไว้
       เปรียบเทียบพฤติกรรมของยีนและโครโมโซมโดยดูจากผลลัพธ์ที่ได้จากการแบ่งนิวเคลียสทั้งMitosis และ Meiosis มีจำนวนกี่เซลล์ แต่ละเซลล์มีจำนวนโครโมโซม และแสดงยีโนไทป์ (genotype) ของแต่ละเซลล์เป็นอย่างไร ที่เกิดขึ้นในหน่วยสืบพันธุ์แต่ละหน่วยแตกต่างกันไป

6. การทำคาริโอไทป์(karyotype) และศึกษาคาริโอไทป์ของคนปกติและคนที่เป็นโรคทางพันธุกรรมนำภาพแสดง mitotic metaphase จากเซลล์ปลายรากของ  Zephyranthes rosea Linn.  (2n = 24) มาตัดโครโมโซมแต่ละแท่งและนำมาจัดเข้าคู่กัน เรียงตามลำดับตำแหน่งเซนโตรเมียร์และขนาดของโครโมโซมตามลำดับ วิธีการตัดแท่งโครโมโซมที่ทากาวหรือเทปกาว 2 หน้า ซึ่งตัดให้เท่ากับขนาดของโค รโมโซมแต่ละคู่ นำมาจัดวางเรียงลำดับ แต่ครั้งแรกอาจจะมีความสับสนในการจัดวาง จึงควรลองและจัดวางโครโมโซมลงบนแผ่นกระดานฟอร์เมก้าสีขาวก่อน จากนั้นจนแน่ใจว่าถูกต้องจึงนำไปติดบนกระดาษ และที่สำคัญควรใช้ปากคีบปลายมนจับภาพโครโมโซม เพื่อป้องกันการยับและเปรอะเปื้อนได้ และนอกจากนั้นให้ศึกษาคาริโอไทป์ของคนปกติเปรียบเทียบกับคนที่เป็นโรคทางพันธุกรรมที่เกิดจากความผิดปกติของจำนวนโครโมโซม

     ผลการทดลอง
1.  จากภาพยนตร์ สไลด์ภาพโปร่งแสง รูปภาพ สไลด์ถาวร และแผ่น CD (CAI) การแบ่งเซลล์
       เรื่องที่เกี่ยวกับการแบ่งนิวเคลียสแบบไมโตซิส
       จากภาพยนตร์เป็นการแบ่งนิวเคลียสที่เกิดขึ้นใน………………………...(เซลล์ร่างกายหรือ germ line cell) เมื่ อแบ่งเสร็จแล้วจะได้เซลล์ใหม่จำนวน……..เซลล์ ซึ่งมี somatic chromosome number เท่ากับ………..ชุด ในระยะ……………………มีโครโมโซมมาเรียงกันบริเวณ equatorial plane ส่วนระยะ anaphase มีการแยกแ ต่ละ…………………………ออกจากกันตรงตำแหน่ง………………………..เซลล์ที่กำลังแบ่งเซลล์นี้ เป็นเซลล์พืชหรือเซลล์สัตว์………………………เพราะ………………………………………………
       เรื่องที่เกี่ยวกับการแบ่งนิวเคลียสแบบไมโอซิส
       จากภาพยนตร์เป็นการแบ่งนิวเคลียสแบบไมโอซิสในเซลล์………(พืชหรือสัตว์) เพราะ  ………………………………………………………………………………………..การแบ่งนิวเคลียสครั้งที่ 1 (Meiosis I) ทำให้ได้เซลล์ใหม่จำนวน……… เซลล์ ที่มี somatic chromosome number เท่ากับ……………… (n หรือ 2n) เมื่อสิ้นสุดการแบ่งเซลล์จะได้จำนวน………เซลล์ ซึ่งแต่ละเซลล์มีลักษณะพันธุกรรม………………(เหมือนหรือแตกต่างกัน)เพราะ……………………………………………………………………………………...

2.  จากการเตรียมสไลด์ศึกษาเองของการแบ่งนิวเคลียสแบบไมโตซิสจากปลายรากหอม ให้วาด
ภาพระยะต่างๆ ที่พบ

          Prophase                               Metaphase                            Anaphase   
   ---------------------------------------------------------------------------------------------------------

          Telophase                              Cytokinesis
   ---------------------------------------------------------------------

3.  จากการเตรียมสไลด์ศึกษาเองของการแบ่งนิวเคลียสแบบไมโอซิสจากดอกกุยช่าย และดอกอื่น ๆ
ให้วาดภาพระยะต่าง ๆ ที่พบ

       Meiosis I
   -----------------------------------------------------------------------------------------------------

       Meiosis II
   -----------------------------------------------------------------------------------------------------

4.  จากการเตรียมสไลด์ศึกษาเองของการแบ่งนิวเคลียสแบบไมโอซิสจากtestis ของตั๊กแตน ให้วาดภาพระยะต่าง ๆ ที่พบ

       Meiosis I
   -----------------------------------------------------------------------------------------------------

       Meiosis II
   -----------------------------------------------------------------------------------------------------

5. จากการศึกษาพฤติกรรมของยีนและโครโมโซมในระยะต่าง ๆ ของการแบ่งนิวเคลียสแบบไมโตซิสและไมโตซิสจากการปั้นดินน้ำมัน จากนั้นให้แสดงพฤติกรรมของยีนและโครโมโซมในระยะต่าง ๆ ของกา รแบ่งนิวเคลียสแบบไมโตซิสและไมโตซิสจากการปั้นดินน้ำมัน   โดยวางดินน้ำมันที่ปันเป็นรูปโครโมโซมในระยะต่างๆ  วางบนกระดาษในหน้า 12-17 ให้สอดคล้องกับระยะของการแบ่งนิวเคลียสระยะต่างๆ   และเขียนเลเบล (label) ประกอบ เช่น เยื่อหุ้มนิวเคลียส  โครโมโซม โครมาติด เส้นสปินเดิล ไคเนโตคอร์ เป็นต้น

ไมโตซิส(Mitosis) 

Prophase     Metaphase       Anaphase         Telophase

                                     Mitotic cell division : Cytokinesis

Daughter Cell (1)          Daughter Cell (2)

       ไมโอซิส (Meiosis) : Meiosis I

Prophase I (leptotene)         Prophase I (zygotene)          Prophase I (pachytene)         Prophase I (diplotene)

ไมโอซิส (Meiosis) : Meiosis I

Prophase I (diakinesis)          Metaphase I          Anaphase I          Telophase I

ไมโอซิส (Meiosis) : Meiosis II

Prophase II          Metaphase II         Anaphase II          Telophase II

Meiotic cell division : Cytokinesis 

Daughter Cell (1)         Daughter Cell (2)         Daughter Cell (3)         Daughter Cell (4)

6.  จากการทำคาริโอไทป์ของ mitotic metaphase chromosome ของบัวจีน (2n = 24) และศึกษาคาริโอไทป์ของคนปกติและคนที่เป็นโรคทางพันธุกรรม

       แสดงคาริโอไทป์ของบัวจีน Zephyranthes rosea Linn. (2n = 24)

       ความผิดปกติของคนที่เป็นโรคทางพันธุกรรม

  Down Syndrome มีความผิดปกติคือ…………………………………………………..

  Turner Syndrome มีความผิดปกติคือ………………………………………………….

  Klinefelter Syndrome มีความผิดปกติคือ……………………………………………..

       วิจารณ์และสรุปผลการทดลอง

ตารางที่ 1 เปรียบเทียบการแบ่งนิวเคลียสแบบไมโตซิสและไมโอซิส

Mitosis Meiosis 1.   Daughter cell ที่ได้มีจำนวน โครโมโซมเหมือนเดิมเท่ากับเซลล์เริ่มต้น 2.      เป็นการแบ่งที่พบในsomatic cell เพื่อเพิ่มจำนวนเซลล์ 3.      มีการแบ่งนิวเคลียส ครั้ง 4.      ในระยะ Prophase ไม่มีการมาเข้าคู่กันของ homologous chromosome ไม่มีการเกิด crossing over     5.      ระยะ Anaphase ส่วนของโครมาติดของเต่ละโครโมโซมแยกไปยังแต่ละขั้วของเซลล์ 6.      มีการแบ่งไซโตพลาสซึม .ครั้ง 7.      ไม่มีระยะ interkinesis   8.      ใน 1 mother cell จะได้ daughter cell จำนวน เซลล์ 9.      เซลล์ลูกที่ได้สามารถแบ่งนิวเคลียสแบบไมโตซิสได้ต่อไปอีก 10.   เซลล์ลูกที่ได้มีลักษณะพันธุกรรม .เซลล์แม่ 11.  หากเซลล์ร่างกายมีจำนวนโครโมโซมเริ่มต้นเท่ากับ2n = 24 ในขณะที่เซลล์มีการแบ่งนิวเคลียสในระยะanaphase จะมี somatic chromosome number เท่ากับ 2n = 48  และเมื่อการแบ่งเซลล์เสร็จสิ้นมี somatic chromosome numberเป็น 2n = .. 12.   ปริมาณดีเอ็นเอ/นิวเคลียสไม่มีการลดลงเมื่อสิ้นสุดการแบ่งนิวเคลียส 1.      เซลล์ลูกที่ได้มีจำนวนโครโมโซมลดลงครึ่งหนึ่งจากเซลล์เริ่มต้น 2.      เป็นการแบ่งที่พบในgerm line cell เพื่อสร้างเซลล์สืบพันธุ์แบบอาศัยเพศ 3.      มีการแบ่งนิวเคลียส ..ครั้ง 4.      ในระยะ Prophase I มีการเข้าคู่กันของ homologous chromosome เกิดเป็น .และ nonsister chromatid ของแต่ละไบวาเลนต์ อาจจะเกิด crossing over เพื่อ . 5.      ระยะ Anaphase I เป็นการแยกตัวของ homologous chromosome 6.      มีการแบ่งไซโตพลาสซึม .ครั้ง 7.      มีระยะ interkinesis คั่นระหว่าง meiosis I และ meiosis II 8.      ใน 1 mother cell จะได้ daughter cell จำนวน ..เซลล์ 9.      เซลล์ลูกที่ได้ไม่สามารถแบ่งนิวเคลียสแบบไมโอซิสได้อีกต่อไป 10.   เซลล์ลูกที่ได้มีลักษณะพันธุกรรม เซลล์แม่ 11.  หากเซลล์ germ line มีจำนวนโครโมโซมเริ่มต้นเท่ากับ2n = 4 ในขณะที่เซลล์มีการแบ่งนิวเคลียสในระยะ anaphase I มี somatic chromosome number เท่ากับ 2n = 4 เมื่อมีการแบ่งเซลล์เสร็จสิ้นได้เซลล์สืบพันธุ์มี somatic chromosome number เท่ากับ n = . 12.   ปริมาณดีเอ็นเอ/นิวเคลียสมีการลดลงครึ่งหนึ่ง เมื่อสิ้นสุดการแบ่งนิวเคลียสในระยะ Meiosis II

ตารางที่ 2     จากแผนภาพที่แสดงคาริโอไทป์แบบต่างๆ ของคนปกติ ให้เติมข้อความลงในช่องว่างให้ถูกต้อง 

ลำดับ	จำนวน		ชนิดความผิดปกติ ของโครโมโซม	ลักษณะ คาริโอไทป์	เพศ	ความผิดปกติหรือ ชื่อโรค (syndrome)
	ปกติ	ผิดปกติ
1	46	-	-	46, XX	ญ	หญิงปกติ
2	46	-	-	46, XY	ช	ชายปกติ
3	46	แท่ง 21 เกิน 1 แท่ง	21 trisomy	47, XY, +21	ช	Down Syndrome
4	46	แท่ง Y เกิน 1 แท่ง		47, XYY	ช	xyy Syndrome
5	46	แท่ง X หายไป 1 แท่ง		45, XO
6	46	แท่ง X เกิน 1 แท่ง		47
7	46	แท่ง 13 เกิน 1 แท่ง		47	ญ/ช	Patua Syndrome
8	46	แท่ง 18 เกิน 1 แท่ง		47	ญ/ช	Edward Syndrome
9	46	แท่ง 5 บางส่วนของ  แขนสั้นหายไป	deletion	46, XY, 5p-	ญ/ช	Cridu Chat Syndrome  (ร้องเหมือนเสียงแมว)